電穿孔技術在轉基因及動物克隆中的應用
電穿孔技術在轉基因及動物克隆中的應用 | 時間: September-15 12:41:51 | 分類:技術欄目
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郝新保 范清宇 Hao Xin-bao Fan Qing-yu
第四軍醫大學全軍骨腫瘤研究所 西安 710038
Institute of Orthopedic Oncology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, China 摘 要 電穿孔技術利用電場造成細胞膜的改變從而將DNA導入細胞內，同時還可用于細胞融合以及動物克隆等。基因電轉移的效率通常比化學法提高1-2個數量級，主要與脈沖波形、長度、緩沖液等有關。方波直流電脈沖應用廣泛，在有關細胞核移植的多項研究報告中均指出其重要作用。關鍵詞 基因轉移，胚胎克隆，電穿孔
過去十年中，關于基因功能的研究取得了豐碩的成果，并因此帶動了基因工程、基因治療以及單克隆抗體技術的進步，而在動物生殖生物學領域的革命性技術進步則導致了綿羊、牛、猴子和小鼠等多種動物的克隆成功。電穿孔技術和儀器的發展在這些成就中扮演了重要角色，使得人類不但能從胚胎細胞克隆動物，甚至能從完全分化的成熟細胞獲得克隆動物。全新的基因操作和生殖技術將為21世紀帶來重要的科學成就。電穿孔技術是利用脈沖電場改變細胞膜的狀態和通透性，達到將DNA導入細胞以及促使細胞發生融合的目的。該技術目前一方面應用于細菌、真菌、植物、昆蟲和哺乳動物細胞的基因轉移，另一方面應用于細胞融合制備雜交細胞和動物克隆等。
1、 在基因轉移和雜交瘤中的應用
1.1 動物和昆蟲細胞轉染電穿孔技術在80年代初期開始用來將DNA導入多種動物細胞[1]，較之傳統的磷酸鈣和脂質體轉染，電穿孔具有操作簡便、轉染效率高等諸多優點，特別是對那些其它方法難以奏效的細胞具有明顯優勢，但它的影響因素也比較多。電場強度：電壓太低時，細胞膜的改變不足以允許DNA分子通過，而電壓過高時又會造成細胞的不可逆損害。對于大多數哺乳動物細胞細胞而言，250-2500V/cm的電壓可獲得有效轉染[2,3]。電脈沖形狀和長度：電脈沖形狀主要有指數衰減式和方波兩種，大多歷時20-100毫秒。緩沖液：通常使用甘露醇和蔗糖等非離子緩沖液，但有報道認為HEPES緩沖液的轉染效率更高，血清也可以提高轉染效率[4]。其它諸如轉染溫度，DNA濃度和構象等均會對轉染效果產生影響。
1.2 大腸桿菌和酵母的轉化電穿孔法在80年代末開始被用于轉化大腸桿菌[5]，由于細菌相對較小，因此與DNA導入動物細胞相比，大腸桿菌通常要求4000-20000V/cm的脈沖強度才能獲得有效轉染。化學法感受態細胞的轉染效率較高只能達到每微克DNA 106-108個轉化體，而電穿孔法卻可以達到109-1010個轉化體的水平，較前者提高10-100倍，因此在制備cDNA文庫等要求較高轉化率的工作中就顯得十分關鍵。 酵母菌電轉化克服了乙酸鋰和原生質體法煩瑣和轉化率低的不足，效率明顯提高[6]。
1.3 細胞融合制備雜交瘤 細胞融合主要用于產生雜交瘤細胞[7,8]。在單克隆抗體的制備過程中，傳統用PEG融合法產生雜交瘤細胞，這在現代化生產中存在許多局限性。而電融合法制備雜交瘤可以大規模地批量、高效融合，縮短了整個生產周期。除此以外，在細胞生物學研究中電融合還被廣泛應用于其它雜交細胞的制備[9]。
2、胚胎工程的核移植和活化 在從簡單的胚胎干細胞轉染到核移植胚胎的電活化中，電穿孔技術都發揮了關鍵的作用，下面是一些重要的應用。
2.1 單性生殖、四倍體及嵌合體
2.2 電融合在核移植技術中的應用
1938年當Hans Spemann提出核移植的設想時克隆技術已經初露端倪。首次在兩棲類動物進行的克隆報道于1952年，但直到1970年青蛙才被克隆成功。核移植是目前多個物種生殖研究的熱點技術。 核移植克隆的目的是將被克隆生物的細胞核轉移到宿主系統中來指導胚胎的發育并產下新的個體。首先將針插入去核卵母細胞的透明帶，把供體細胞注入卵母細胞的卵黃周間隙。細胞融合儀提供的交流電使供體細胞和卵母細胞排列好，隨后1到數個直流波使核移植胚胎被激活而發生分裂。分裂產生的胚胎細胞被移植到代理母親子宮妊娠直到生產。
3、供核來源不同的核移植
3.1 以胚胎為基礎的核移植 由核移植產生的哺乳動物胚胎克隆涉及8-64個細胞胚胎的其中一個細胞與去核的成熟卵母細胞之間的融合。Ilmense 和Hoppe于1981年首次報道了產生成活個體的核移植[15]。他們的研究沒有被重復出來，但卻產生了效率更高的核移植技術[16]。許多物種成功的核移植實驗都使用了電融合技術。 Li Meng和Don Wolf把這一技術應用于靈長類于1997年發表了克隆恒河猴的實驗研究結果[17]。他們的工作為基因治療提供了有效的動物模型。
3.2 以胚胎和初生動物細胞系為基礎的核移植 應用胚胎分裂球作為細胞核供體有許多限制。如何產生合適的胚胎細胞是個瓶頸，而且分離的分裂球難以在體外進行遺傳操作，使得克隆之前無法有效地向其轉移基因。因此許多學者從事發展基于胚胎或初生動物細胞系的核移植策略。 1996年位于蘇格蘭的Ian Wilmut研究小組報告他們利用細胞系獲得轉基因綿羊的結果[18]。用于核移植的細胞系來自于胚胎，已經在體外培養了6-13代，在移植之前用血清饑餓法誘導其停止生長。1997年利用轉染人IX因子基因的綿羊羊胎纖維母細胞獲得的核移植綿羊克隆獲得成功[19]。 Cibelli, Stice and Robl首次報告了使用永生化的胎牛纖維母細胞作為細胞核供體獲得的克隆轉基因奶牛。他們的工作首次證明活躍分裂的細胞在進行細胞核移植以后可以繼續發育[20]。
3.3 以分化成熟細胞為基礎的核移植 應用細胞系的核移植研究為分化成熟細胞的克隆掃除了障礙。Ian Wilmut于1997年報告了第一只來自分化成熟細胞的動物克隆---綿羊多利[21]，這一成果震動了整個世界。為多利提供細胞核的是一只成年綿羊的乳腺上皮細胞，同樣應用了血清饑餓誘導法處理細胞。 此后不斷有應用體細胞作為細胞核供體獲得克隆動物的報告[22-24]，證明了多利的技術路線確實是可行的。
4、電穿孔設備的性能 早期電穿孔設備的波形和時間都是固定的，使用不便且效果差。20年來的發展使得設備本身和附件的技術水平都有了很大提高。
4.1脈沖形狀早期的指數衰減式脈沖一直沿用至今，保留在低端產品的設計上，主要用于基因轉染。新開發的方波脈沖產品成為目前市場上的主流，在眾多品牌中方波脈沖的純度和重現性并不完全一致，應選擇那些專業廠家的產品。有的產品用一系列高頻脈沖代替方波，其導入基因和細胞融合的效率還有待于進一步證實。除了直流脈沖以外，有些用于細胞融合的設備還可以產生非正弦交流波使細胞按電場方向排列，可比單純直流脈沖獲得更高的融合效率。
4.2 脈沖強度和時間 由于細菌和細胞的操作需要不同的脈沖強度和時間，而低端產品的強度和時間調整范圍都比較窄，因此作用單一。通用型產品可以產生0-3000V的電壓以及1微秒-10秒的脈沖，因此可應用于細胞、細菌轉基因和細胞融合、胚胎工程等多種操作。
4.3 外圍設備帶有監視器、打印機和遙控器接口的細胞操作系統已經出現，與這些設備配套使用能方便地記錄和優化實驗參數，可以在較短的時間內取得較好結果。
