原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的由來及發(fā)展
原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的由來及發(fā)展 | 時(shí)間: December-7 11:15:59 | 分類:技術(shù)欄目
凌儀生物提供高速離心機(jī)，美國Bio-rad伯樂電泳，德國eppendorf艾本德移液器，美國ABI基因擴(kuò)增儀PCR，雅培原位雜交儀，Thermo熱電離心機(jī)等實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備，以及Corning康寧，Axygen愛思進(jìn)，Greiner格瑞拉等耗材要省錢，別錯過哦。 原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)簡稱原位雜交（In situ hybridization），如上所述，屬于固相核酸分子雜交的范疇。但它區(qū)別于固相核酸分子雜交中的任何一種核酸分子雜交技術(shù)。菌落雜交系細(xì)菌裂解釋放出DNA，然后進(jìn)行雜交。Southern印跡雜交法是以鑒定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印跡雜交法是用以檢測某一特定的RNA片段的。它們都只能證明該病原體、細(xì)胞或組織中是否存在待測的核酸而不能證明該核酸分子在細(xì)胞或組織中存在的部位。1969年美國耶魯大學(xué)Gall 和Pardue首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，確定該基因定位于卵母細(xì)胞的核仁中。與此同時(shí)，Buongiorno – Nardelli和Amaldi,John及其同事等相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交細(xì)胞或組織化學(xué)技術(shù)。Orth（1970）應(yīng)用3H標(biāo)記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進(jìn)行雜交，首次用原位雜交檢測了病毒DNA在細(xì)胞中的定位，但當(dāng)時(shí)的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞，探針均采用同位素標(biāo)記。
由于同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點(diǎn)，科學(xué)工作者們開始探索用非放射性的標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針進(jìn)行原位雜交。Bauman（1981）等首先應(yīng)用熒光素標(biāo)記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。Shroyer（1982）報(bào)道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）標(biāo)記DNA探針，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗體來識別雜交后的探針，較后經(jīng)免疫過氧化物酶的方法來定位雜交探針。這兩種方法至今仍有采用，但因敏感度不夠高，應(yīng)用不夠普遍。
Pezzella（1987）創(chuàng)建了用磺基化DNA探針來做細(xì)胞或組織原位雜交的方法，其基本原理是使DNA探針的胞嘧啶堿基磺基化，利用單克隆抗體識別磺基化探針，再通過免疫組化方法顯示結(jié)合的單克隆抗體，從而對雜交結(jié)合的探針進(jìn)行定位。本法的優(yōu)點(diǎn)是磺基化DAN探針標(biāo)記簡便，不需作缺口平移標(biāo)記，敏感度也較高。但自生物素和高辛標(biāo)記探針技術(shù)建立后，已有取而代之的趨勢。生物素標(biāo)記探針技術(shù)是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素標(biāo)記的探針在組織切片上檢測了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結(jié)合，過氧化物酶-抗過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細(xì)胞中的定位。生物素標(biāo)記探針技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用，特別是在病毒學(xué)和病理學(xué)的臨床診斷中。這種生物素標(biāo)記技術(shù)又叫酶促生物素標(biāo)記技術(shù)。另一種叫光促生物素標(biāo)記核酸技術(shù)，該技術(shù)是用光敏生物素（Photobiotin）標(biāo)記核酸。目前應(yīng)用的光敏生物素有乙酸鹽和補(bǔ)骨脂素生物素，它們都是由三個部分組成：光敏基團(tuán)、連結(jié)臂和生物素（圖20-1）。在強(qiáng)光下，不需酶反應(yīng)，光敏生物素的光敏基團(tuán)即可與核酸中的堿基相結(jié)合。光敏生物素標(biāo)記核酸，方法簡單，靈敏度也不低，但標(biāo)記效率不高，每100～150個堿基才能標(biāo)記一個生物素，對于短的基因探針特別是寡核苷酸探針不宜使用，以免因標(biāo)記數(shù)過少而影響靈敏度（Forster et al 1985）。
