蛋白質(zhì)檢測：蛋白質(zhì)印跡法
蛋白質(zhì)檢測：蛋白質(zhì)印跡法 | 時(shí)間: December-7 11:17:56 | 分類:技術(shù)欄目
凌儀生物提供高速離心機(jī)，美國Bio-rad伯樂電泳，德國eppendorf艾本德移液器，美國ABI基因擴(kuò)增儀PCR，雅培原位雜交儀，Thermo熱電離心機(jī)等實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備，以及Corning康寧，Axygen愛思進(jìn)，Greiner格瑞拉等耗材要省錢，別錯(cuò)過哦。蛋白質(zhì)檢測：蛋白質(zhì)印跡法與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。
1把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。
1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動(dòng)去除所有的氣泡。
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。
5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移。
6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。2將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。
3用100ml水洗滌纖維素膜，必要時(shí)可用脫色緩沖液。
4膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí)。
5室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
6用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
7袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
8混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)（或4℃過夜）
9用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。
10將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。
11按步驟9洗滌。
12加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。
13按步驟9洗滌。
14配制顯色指示劑/底物：混合顯色指示劑原液3.0ml，PBS 9.0ml，加入1%過氧化氫150.0微升。立即使用。
15于室溫下?lián)u動(dòng)直至出現(xiàn)紫色并開始看到背景（1~10分鐘）。
16將薄膜轉(zhuǎn)到另一盛水容器中洗滌，終止顯色反應(yīng)，空氣干燥，封入塑料袋中避光保存。
