水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA

水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA | 時間: January-5 20:43:31 | 分類:技術欄目

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學習水平式瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度、構型、含量和分子量大小。

實驗原理

 閉合環狀質粒、線性質粒和開環質粒DNA由于構形不同，在加溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳上呈現不同的遷移率，因而在紫外燈下觀察，能區別閉合環狀質粒DNA（cccDNA）、線性質粒DNA（L-DNA）和開環質粒DNA（ocDNA）。

實驗材料和試劑

 （一）實驗樣品

 質粒pUC118

 （二）試劑

 1．l DNA/HindIII分子量標準

 2．溴酚藍指示劑點樣緩沖液

    0.2%     溴酚藍

    50%       蔗糖

 3．1mg/ml溴化乙錠溶液

 4．電泳緩沖液（TAE）

    40 mmol/L   Tris-乙酸

    1 mol/L     EDTA

 (配制方法：24.2克Tris堿，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml）

5．0.7% 瓊脂糖凝膠

（配制方法：稱取瓊脂糖0.35克，加入50ml TAE電泳緩沖液）

 （三）儀器

 微量移液器           電泳儀

 水平電泳槽           透射紫外觀察儀

實驗步驟

 1．選擇合適的水平式電泳槽，調節電泳槽平面至水平。檢查穩壓電源與正負極的線路。

 2．選擇孔徑大小合適的點樣梳子，垂直架在電泳膠模的一端，使點樣梳子底部離電泳膠模底部的距離為1.0mm。

 3．制備0.7%瓊脂糖凝膠，100℃水浴加熱至瓊脂糖融化均勻。

 4．用吸管取少量瓊脂糖凝膠溶液將電泳膠模四周密封好，防止澆灌瓊脂糖凝膠板時發生滲透。待瓊脂糖凝膠冷卻至60℃左右時，加入一滴溴化乙錠，搖勻，輕輕倒入電泳膠模中，瓊脂糖凝膠的厚度在3～5mm。倒膠時要避免產生氣泡，若有氣泡可用吸管小心吸去。

 5．瓊脂糖凝膠凝固后，在室溫放置20分鐘，小心拔掉點樣梳子和電泳膠模兩端的擋板，保持點樣孔的完好。

 6．將電泳膠模放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，使電泳緩沖液面高出瓊脂糖凝膠表面1～2mm。如點樣孔內有氣泡，用吸管小心吸出，以免影響加樣。

 7．將15ml DNA樣品與1/5體積的溴酚藍指示劑點樣緩沖液混合。上樣緩沖液不僅可以提高樣品的密度，使樣品均勻沉到樣品孔內，還可以使樣品帶顏色，便于上樣和估計電泳時間和判斷電泳的位置。

 8．用微量移液器將樣品小心加入加樣孔內，記錄樣品點樣秩序。

 9．蓋上電泳槽，開啟電源開關，較高電壓不超過5V/cm（100～150V恒壓電泳），使DNA從負極向正極移動。

 10．電泳時間隨實驗的具體要求而異。電泳一般需1～3小時。電泳完畢后關閉電源，戴一次性塑料手套取出凝膠，盡可能將所有的電泳緩沖液淋干，在254nm波長的透射紫外燈下觀察。

 

【提示】

 （一）瓊脂糖凝膠電泳

 1．瓊脂糖凝膠的性質

 瓊脂糖是從海藻中提取的一種直鏈多糖，它由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列組成的線型多聚糖。當瓊脂糖加熱至90～100℃左右，即可形成清亮透明的液體。澆在模板上冷卻至40～45℃時，凝固形成凝膠。瓊脂糖帶有親水性，不含有帶電荷的基團，不引起DNA變性，又不吸附被分離的物質，因此它是一種很好的凝膠劑。瓊脂糖凝膠可區分相差100bp的DNA片段。

 2．DNA分子的遷移率

 DNA分子在電泳中的遷移率的因素是多方面的，除了決定于DNA分子大小與構型外，還有瓊脂糖凝膠的濃度、電壓大小、緩沖液pH值和電泳時的溫度等。

 （二）實驗操作中注意的問題

 1．加熱溶解瓊脂糖時應不斷地搖動容器，使附于壁上的顆粒也完全溶解。

 2．溴化乙錠是一種強致癌劑，并有中度毒性，因此必須十分謹慎小心。操作時一定要戴手套，用過的手套要及時將手套順手翻過來，讓污染有溴化乙錠的面朝里。

 3．用254nm波長的紫外光進行觀察的效果比366nm清晰，但產生的切口DNA量也較高。紫外光對眼睛有害，觀察時應戴上眼鏡或防護面罩。

 

 

 

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