瓊脂糖凝膠電泳DNA回收實(shí)驗(yàn)方法和注意事項(xiàng)

瓊脂糖凝膠電泳DNA回收實(shí)驗(yàn)方法和注意事項(xiàng) | 時間: May-15 17:00:14 | 分類:技術(shù)欄目

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及重要注意事項(xiàng)

1．第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明在Buffer PW中加入無水乙醇。

2．使用前請檢查Buffer PG，如果出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，可在37℃水浴中放置3-5分鐘，即可恢復(fù)澄清。

3．電泳時較好使用新的電泳緩沖液，避免影響電泳和回收效果；如下一步實(shí)驗(yàn)要求較高，請盡量使用TAE電泳緩沖液。

4．切膠時，紫外照射時間應(yīng)盡量短，以免對DNA造成損傷。

5．回收率與初始DNA量和洗脫體積有關(guān)，初始量越少，洗脫體積越少，回收率越低。

6．將水浴鍋預(yù)熱至50℃。

7．Buffer PG中含有pH指示劑，當(dāng)pH≤7.5時溶液的顏色為黃色，此時DNA才能夠有效的與膜結(jié)合，當(dāng)pH值偏高時溶液的顏色變?yōu)榻奂t色和紫色，需要進(jìn)行調(diào)整。

8．所有離心步驟均可室溫下

操作步驟

1．將單一目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分），放入干凈的離心管（自備）中，稱量計(jì)算凝膠重量（提前記錄離心管重量）。注意：若膠塊的體積過大，可將膠塊切成碎塊。

2．向膠塊中加入1倍體積Buffer PG（如凝膠重為100 mg，其體積可視為100 μl，依此類推）。

3．50℃水浴溫育，其間每隔2-3分鐘溫和地上下顛倒離心管，待溶膠液為黃色，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊，可再補(bǔ)加一些溶膠液或繼續(xù)放置幾分鐘直至膠塊完全溶解。

注意：1）凝膠完全融解后膠溶液為黃色，可進(jìn)行后續(xù)操作；若膠溶液為桔紅色或紫色，可向膠溶液中加10-30 μl 的3 M醋酸鈉（pH 5.0），將溶液的顏色調(diào)為黃色后再進(jìn)行后續(xù)操作。

2）膠塊完全溶解后較好將膠溶液溫度降至室溫再上柱，吸附柱在較高溫度時結(jié)合DNA的能力較弱。

4．（可選步驟）當(dāng)回收片段<300 bp時，應(yīng)加入1/2膠體積的異丙醇，上下顛倒混勻（如凝膠重100 mg，則加入50 μl的異丙醇）。

5．柱平衡：向已裝入收集管中的吸附柱（Spin Columns DM）中加入200 μl Buffer PS，13,000 rpm（~16,200×g）離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6．將步驟3或4所得溶液加入到已裝入收集管的吸附柱中，室溫放置2分鐘，13,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。注意：吸附柱容積為750 μl，若樣品體積大于750 μl 可分批加入。

7．向吸附柱中加入450 μl Buffer PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），13,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。注意：如果純化的DNA用于鹽敏感的實(shí)驗(yàn)（例如平末端連接或直接測序），建議加入Buffer PW

靜置2-5分鐘再離心。

8．重復(fù)步驟7。

9．13,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR等）。10．將吸附柱放到一個新的1.5 ml離心管（自備）中，向吸附膜中間位置懸空滴加50 μl

Buffer EB，室溫放置2分鐘。13,000 rpm離心1分鐘，收集DNA溶液。-20℃保．DNA。

注意：1）為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新滴加到吸附柱中，室溫放置2分鐘，13,000 rpm離心1分鐘。

2）洗脫體積不應(yīng)小于30 μl，體積過少會影響回收效率。

3）回收大于10 kb的DNA片段時，Buffer EB應(yīng)在50℃水浴中預(yù)熱，可增加回收效率。

備注：本試劑盒也適用于PCR產(chǎn)物的純化回收。在PCR反應(yīng)液中加入等體積的BufferPG，充分混勻（對于回收小于150bp的小片段可將溶液的體積增加到3倍以提高回收率）接上述步驟5進(jìn)行后續(xù)操作。